多光子显微镜已经在神经科学研究以及医学在体无标记成像上广泛应用，为了实现小型化的多光子显微镜，可以将大体量器件和自由空间光路用光纤来替代，有图1中所示的两种实现方式[1]。在图1(a)中，飞秒脉冲由单模光纤(SMF)或空芯光子带隙光纤(PBF)来传输，多光子显微镜信号光由大芯径、高NA的多模光纤（或者光纤束）收集。这种双光纤配置体积较大，多光子内窥镜一般会使用单根光纤（例如双包层光子晶体光纤）来传输激发光和收集信号光，如图1(b)所示。
图1 双光纤和单光纤传输方式示意图 [1]
台式显微镜中高NA物镜体积大、重量重，无法集成，在小型化时可采用梯度折射率(GRIN)透镜代替。GRIN透镜具有空间变化的折射率，一般是圆柱形，尺寸小且分辨率在微米量级。此外，复合GRIN透镜可以有效克服单GRIN透镜视场有限、工作距离短等缺点。
小型化多光子显微镜一般采用光纤扫描或者MEMs镜扫描。光纤扫描包括近端和远端扫描，近端扫描利用Galvo镜与光纤束一起实现，如图2(a)所示。这种扫描方案的优点是空间上分离比较远，探头的大小与扫描元件大小无关。图2(b)中的光纤尖端扫描是常见的远端扫描方式。一般会使用压电驱动器来驱动光纤尾端的机械共振振动实现扫描，其优势在于低成本、低功耗以及高分辨率。如图2(c)所示的MEMs扫描技术，将驱动器与微光学元件组合在一起，体积小、功耗低，扫描速度相对较高而且易于集成。
图2 小型化横向扫描方式示意图[1]
多光子显微镜系统还需要实现轴向扫描。移动物镜或样品是实现轴向扫描最直接的方法，一般使用压电电机来实现，优点是可以提供稳定的光学特性和恒定轴向分辨率，但电机体积大不易集成。第二种方法是波前调制或散焦，可以使用可变形透镜（如电可调透镜或电润湿可调透镜技术）、空间光调制或变焦透镜改变焦平面以实现深度扫描，其中MEMs技术可用于制造具有可调焦距在数百微米甚至毫米量级的微型微透镜，以取代物镜深入样品成像，见图3。
图3 MEMs微型透镜[1]
第三种方法是使用在光路共轭位放置物镜及反射镜来实现远程聚焦，见图4， 但是这种方案所需要的额外镜面和扫描结构可能会增加整体体积和质量，限制了其生物医学成像的体内应用。
图4 遥控聚焦原理及效果示意图[1]未来，随着MEMS微加工技术和半导体激光技术的进步，所有光学元件都可以集成在一起，因此可以实现更小的尺寸、更宽的轴向扫描范围、更大的视场以及更高的扫描速率和更高的分辨率。结合上述技术，小型化多光子显微镜可以为生物研究及医学临床提供强有力的工具。
参考文献：
[1] Yu, X.; Zhou, L.; Qi, T.Zhao, H.; Xie, H. MEMS Enabled Miniature Two-Photon Microscopyfor Biomedical Imaging.Micromachines 2023, 14, 470.
原文标题 : 多光子显微镜成像技术之三十七 小型化多光子显微镜核心器件
